全基因组甲基化测序WGBS

WGBS, Whole Genome MethylC equencing

产品简介

iGeneTech™全基因组甲基化测序(WGBS, Whole Genome Bisulfite Sequencing) 是将重亚硫酸盐处理与Illumina HiSeq系列平台高通量测序相结合, 研究全基因组范围内的精确甲基化的整体解决方案。iGeneTech™采用MethylC-Seq方向性(directional)建库方法更加精准的绘制单碱基分辨率的DNA甲基化图谱, 被应用于研究物种特定DNA区域甲基化与特定表型之间的关联。

稳定高效的项目流程,21个工作日快速交付;

Lamda DNA阳性质控,亚硫酸盐翻转效率>98%, 定制iGeneTechTM酶极大提高扩增效率,增强文库制备的稳定性;

对全基因组5mC信息进行高效扫描,保证数据精度和质量,一般样本100G raw data,Q30不低于80%;

多样本的覆盖区域重复性高,适用于多样本间的差异分析。

应用领域

医学
医学:阐释疾病的发生发展机制,发现与疾病相关的生物标志物,以应用于疾病诊断、治疗、预后及用药研究。
动植物
动植物:动植物生长发育、抗病、抗逆机制研究以及育种研究。同时可实时更新和补充关联信息的完整性

服务流程

案例介绍

研究目的:基于全基因组重亚硫酸盐测序深入研究结肠癌中的甲基化 。

研究方法:利用全基因组重亚硫酸盐测序,比较原发性结肠癌和邻近正常结肠组织在全基因组单碱基水平的甲基化差异。

部分结论:与邻近正常结肠组织相比,结肠癌中通常具有低甲基化的PMDs区域(部分甲基化区域)。 在PMDs区域,高甲基化焦点区和大范围的低甲基化区域 (>100 kb) 密切相关,与核纤层相关结构域一致 。

样品要求

样品类型 样品规格 样品采集/运输
DNA(新鲜/冰冻样品) >1.0μg,浓度>20ng/μl 干冰运输
血液(全血) >1ml EDTA抗凝,2-8 °C冷藏运输
新鲜组织 >2g 低于-20 °C(干冰)冷冻运输
唾液 >1ml 唾液保存液混合可室温运输,直接收集唾液需冷冻运输
CtDNA >1ml 要求血浆,干冰运输
DNA(取自FFPE) >1.5μ,浓度>20ng/μl 干冰运输
细胞 >8×10 6 去除培养液,PBS清洗1次后液氮速冻,干冰运输
石蜡切片 >5片 10×10mm面积,常温运输,穿刺组织>10片
石蜡包埋块 >1块 不小于1×1×1mm常温运输
单细胞 >8×106 液氮速冻,干冰运输

常见问题

1. DNA甲基化测序有哪几种方法?

答:目前DNA甲基化测序的主要有WGMS、MeDIP与RRBS. WGMS是全基因组、单碱基分辨率、绝对甲基化水平检测的方法,是DNA甲基化检测的金标准。MeDIP是基于5mC特异性抗体去富集带有5甲基化修饰的胞嘧啶的DNA片段, 也是全基因组覆盖,但无法实现单碱基分辨率(分辨率为150bp左右),只能通过富集peak来判断某一段区域是否存在甲基化,无法得到绝对的甲基化水平, 因此适合于样本间的相对比较。RRBS是简化的、具有代表性的亚硫酸盐测序,通过MspI酶切基因组,选取小片段DNA进行亚硫酸盐处理后上机测序, 以人类为例大约能测得CpG岛40%的CpG、promoter 20%的CpG. iGeneTech™提供以上3种主流的DNA甲基化测序服务。

2. DNA甲基化测序如何选择合适的测序方法?

答:普通WGMS与MeDIP是指全基因组水平上的测序,RRBS则是选择了甲基化程度较高的区域进行测序。 在测序精确度方面,WGMS与RRBS可精确到单个碱基,而MeDIP只精确到100bp左右的甲基化区域,客户可根据自己的研究目的和经费情况选择合适的测序方法。

3. DNA甲基化测序如何选择合适的测序深度?

答:WGMS是对被测样品进行全基因组DNA甲基化的检测,为了得到每个C的准确甲基化水平, 一般推荐每个位置的测序深度20×以上。因此,建议检测至少30倍于物种基因组size的raw data.

4. 为什么WGMS所得的raw data 产量和Q30比例较全基因组重测序的低?

答:哺乳动物基因组中C的平均甲基化水平约为3%,CpG的平均甲基化水平50%-80%不等。用WGMS技术得到的DNA中,绝大部分的C均转化为U,在测序过程中呈现为T. 因此,WGMS文库属于碱基极度不平衡(read1中C含量极低、read2中G含量极低)的类型, Illumina 测序仪在cluster 定位过程中会过滤较高比例的cluster,使得raw data产量降低;另外由于GC含量较极端,SBS过程中质量值也较容易下降。

5. WGMS的原理是什么?

答:亚硫酸盐处理(Bisulfite Treatment)测序是DNA甲基化检测的金标准。非甲基化C在bisulfite treatment后,会变成U;而甲基化C在bisulfite treatment后能保持不变。随后经过PCR扩增过程中,U被T取代, 我们可以通过判断C是否变成T来判断该C是否有甲基化修饰。利用二代测序,我们可以对整个被测基因组进行DNA甲基化的测序。

6. 亚硫酸盐处理后非甲基化C转化成U的转化率如何评估?

答:iGeneTech™选用没有甲基化修饰的Lambda DNA作为外标,以质量比1%的量掺入被测基因组DNA,共同进行WGMS的文库制备。测序完成后,通过与Lambda DNA的参考基因组进行比对,统计Lambda DNA的平均甲基化水平, 最后得出亚硫酸盐处理后非甲基化C转化成U的转化率(100%减去Lambda DNA平均甲基化水平)。 iGeneTech™承诺WGMS的亚硫酸盐处理后非甲基化C转化成U的转化率高于99%.

7. WGMS采用哪种建库方法,有什么特点?

答:iGeneTech™ WGMS采用MethylC-Seq方向性(directional) 建库方法,其测序结果只有两条original reads,分别为Bisulfite Watson (BSW) 或 BisulfiteCrick (BSC) . 因此,在进行reads比对时,BSW和BSC只需要分别与C-T转换和G-A转换的参考基因组进行比对即可。 而一般所使用的BS-Seq为非方向性(non-directional)的建库方法,测序结果包括四条reads, 即 BSW、 BSC以及它们分别的互补链(complementary reads,BSWRC和BSCRC)。 因此,在进行reads比对时,需要进行四次比对。MethylC-Seq相比于BS-Seq,具有较高的唯一比对率,并减少了数据比对的时间。 iGeneTech™采用的正是MethylC-Seq.

8. 全基因组甲基化测序中哪些因素会影响测序结果?

答:样品DNA的长度、亚硫酸盐翻转处理过程、扩增的效率、测序深度和覆盖度等因素都可能会影响到实验结果。