简化甲基化测序RRBS

RRBS, Reduced Representation Bisulfite Sequencing

产品简介

iGeneTech™简化甲基化测序(RRBS, Reduced Representation Bisulfite Sequencing)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切, 富集启动子及CpG岛区域,进行硫化处理及片段富集并制备高质量文库,之后使用Illumina HiSeq系列平台进行高通量测序的整体解决方案。

稳定高效的项目流程,21个工作日快速交付;

多样本的覆盖区域重复性高,适用于多样本间的差异分析;

数据质量保证,5G clean data,Q30不低于80%;

Lamda DNA阳性质控,亚硫酸盐翻转效率>98%, 定制iGeneTechTM酶极大提高扩增效率,提高文库制备的稳定性。

应用领域

医学
医学:阐释疾病的发生发展机制,发现与疾病相关的生物标志物,以应用于疾病诊断、治疗、预后及用药研究。
动植物
动植物:动植物生长发育、抗病、抗逆机制研究以及育种研究。同时可实时更新和补充关联信息的完整性

服务流程

案例介绍

研究目的:探究甲基化导致的RRAD(与糖尿病有联系的ras相关蛋白)基因失活与肿瘤发生的关系 。

研究方法:通过简化甲基化重亚硫酸盐测序(reduced representation bisulfite sequencing,RRBS)和数字基因表达两种方法, 比较T29H(人类卵巢上皮细胞系RasV12基因转化细胞系)和T29(永生非转化细胞系)在Ras调控的转录组和表观遗传方面的差异。

部分结论:RasV12基因调控的致癌性转化伴随有RRAD启动子高度甲基化和RRAD表达缺失。通过基因敲除和过表达技术,发现RRAD通过抑制葡萄糖转座子的表达,抑制了葡萄糖摄取和乳酸盐的产生;RRAD在T29H的过表达抑制了裸鼠模型肿瘤的形成,表明RRAD是一个肿瘤抑制基因。推测,RasV12基因调控的致癌性转化诱发了RRAD表观遗传失活,从而促进了葡萄糖的摄取,可能导致卵巢癌的发生。

样品要求

样品类型 样品规格 样品采集/运输
DNA(新鲜/冰冻样品) >1.0μg,浓度>20ng/μl 干冰运输
血液(全血) >1ml EDTA抗凝,2-8 °C冷藏运输
新鲜组织 >2g 低于-20 °C(干冰)冷冻运输
唾液 >1ml 唾液保存液混合可室温运输,直接收集唾液需冷冻运输
CtDNA >1ml 要求血浆,干冰运输
DNA(取自FFPE) >1.5μ,浓度>20ng/μl 干冰运输
细胞 >8×10 6 去除培养液,PBS清洗1次后液氮速冻,干冰运输
石蜡切片 >5片 10×10mm面积,常温运输,穿刺组织>10片
石蜡包埋块 >1块 不小于1×1×1mm常温运输
单细胞 >8×106 液氮速冻,干冰运输

常见问题

1. DNA甲基化测序有哪几种方法?

答:目前DNA甲基化测序的主要有WGMS、MeDIP与RRBS. WGMS是全基因组、单碱基分辨率、绝对甲基化水平检测的方法, 是DNA甲基化检测的金标准。MeDIP是基于5mC特异性抗体去富集带有5甲基化修饰的胞嘧啶的DNA片段,也是全基因组覆盖, 但无法实现单碱基分辨率(分辨率为150bp左右),只能通过富集peak来判断某一段区域是否存在甲基化,无法得到绝对的甲基化水平, 因此适合于样本间的相对比较。RRBS是简化的、具有代表性的亚硫酸盐测序 通过MspI酶切基因组,选取小片段DNA进行亚硫酸盐处理后上机测序,以人类为例大约能测得CpG岛40%的CpG、promoter 20%的CpG. iGeneTech™提供以上3种主流的DNA甲基化测序服务。

2. DNA甲基化测序如何选择合适的测序方法?

答:普通WGMS与MeDIP是指全基因组水平上的测序, RRBS则是选择了甲基化程度较高的区域进行测序。 在测序精确度方面,WGMS与RRBS可精确到单个碱基,而MeDIP只精确到100bp左右的甲基化区域,客户可根据自己的研究目的和经费情况选择合适的测序方法。

3. RRBS为何要求基因组DNA完整度高?

答:RRBS是利用限制性内切酶MspI对基因组进行酶切后, 再对特定大小(以人类为例选取40-220bp)的DNA片段进行胶回收。 因此,当基因组DNA不完整时,会有大量的非酶切区域被回收,最终导致测序结果中有效数据量偏低。

4. 如何预估RRBS对被测物种基因组的理论覆盖度?

答:可利用MspI的识别位点CCGG,对被测物种基因组进行模拟酶切,再对特定大小的酶切片段进行注释,统计总的区域大小、区域中CpG的数量及在基因组中所有CpG的占比、所覆盖CpG的数量及在不同基因元件(promoter、CGI等)中所有CpG的占比。 iGeneTech™会提供常见模式物种的模拟酶切统计结果供参考。

5. RRBS是否同样需要关注亚硫酸盐处理后非甲基化C转化成U的转化率?

答:是的,iGeneTech™在进行RRBS时, 同样会掺入一定比例的非甲基化Lambda DNA. iGeneTech™承诺RRBS测序结果中比对到Lambda DNA的亚硫酸盐处理后非甲基化C转化成U的转化率高于99%。

6. iGeneTech™是否提供痕量的基因组DNA起始的RRBS测序?

答:是的,iGeneTech™对痕量起始的RRBS建库具有丰富的经验,并提供定量化的RRBS技术(Q-RRBS)。此类项目的服务需特殊定制。