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AnchorSeq锚定多重定制产品

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AnchorSeq锚定多重定制产品
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产品介绍


艾吉泰康AnchorSeq锚定多重扩增子测序技术是一种将锚定多重PCR反应与二代测序相结合的靶向捕获测序技术,利用5'端锚定引物及巢式多重聚合酶链式反应(PCR)技术,对核酸片段进行高效、特异性的扩增,实现对cfDNA样本低频突变与融合事件的有效检测。

产品优势


1. 模板分子利用率高
有效提高接头连接效率,充分保证模板的利用率。
2. UMI技术降噪
通过接头连接引入UMI接头,可满足低频突变检测的需求。
3. UDI减少数据串扰
搭配Illumina平台UDI接头,有效减少数据串扰。
4. 极速定制周期
从提交位点设计到合成交付,极致周期,满足MRD检测需求。

检测案例一:AnchorSeq™锚定多重扩增子测序技术


实验方案:投入30 ng Horizon 0.1% cfDNA参考标准品(稀释10倍),使用142重引物的Panel进行建库扩增,去重前~100,000X平均深度。
数据表现:已知8个变异位点可以准确检测到4个位点。

Gene Mutation Expected VAF Sample 1 Sample 2
AD DP VAF AD DP VAF
EGFR c.2573T>G 0.01% 6 101150 0.06% - - -
EGFR c.2235_2249del15 0.01% - - - - - -
EGFR c.2369C>T 0.01% 13 15854 0.08% 4 20412 0.02%
EGFR c.2307_2308insGCCAGCGTG 0.01% - - - - - -
KRAS c.35G>A 0.013% - - - 15 8705 0.17%
NRAS c.181C>A 0.013% - - - 2 9440 0.02%
NRAS c.175G>A 0.013% 4 7343 0.05% 8 9445 0.08%
PIK3CA c.1633G>A 0.013% 4 5896 0.07% - - -

 

定制流程


 

 

 

1. TargetSeq定制产品可以对哪些物种进行探针设计?
答:TargetSeq定制产品不仅可以对人源进行探针设计,对动植物及微生物(包括多个物种)等其他物种也可以进行探针设计。非人源时,需要同时提供中文名和拉丁名、参考基因组信息(如NCBI的核酸序列号,或者基因组下载链接);若为多物种,分行列出提供以上信息;微生物建议提供fa格式的DNA序列。

2. TargetSeq定制产品在探针设计时需要提供哪些信息?
答:在Panel设计前,需要客户提供物种、参考基因组和位点信息,或者物种、参考基因组、基因名称、设计的功能区域等信息,详细请见艾吉泰康Panel设计信息单。针对InDel、SV、CNV等特殊变异,艾吉泰康可根据提供的变异信息特殊设计探针,提高变异的检出。
 
3. 捕获效率和目标区域有关系吗?
答:捕获效率受目标区域大小、高GC区域、高重复区域、同源序列、样本保守性等多个因素影响,需要根据物种参考基因组和选点综合评估捕获效率。艾吉泰康基于多因素算法,同时对难捕获区域特殊设计,以提供覆盖度和捕获效率最佳的探针设计方案。
 
4. DNA Panel的探针方案设计是什么样的呢?
答:针对人源panel,TargetSeq® Panel基于热力学稳定性进行 2-3X 叠瓦式设计,同时针对难捕获区域、不同突变类型(如InDel、CNV、STR、Fusion等)进行探针优化设计,提高Panel的均一性和关键突变的检出率。针对动植物产品,艾吉泰康基于自主研发的算法对位点和参考基因组综合评估,同时基于热力学稳定性进行单层探针设计,以提供数据指标优异且开发费用较低的探针设计方案。
 
5. 设计报告的Loci.bed和ProbeCov.bed有什么差异,应该用哪个?
答:艾吉泰康的设计报告中会提供多种bed文件,以满足不同的分析场景。Loci.Bed为目标区域bed文件,可用于目标区域覆盖度、均一度等指标评估及后续目标区域变异分析;ProbeCov.bed是探针覆盖区域的bed文件,可用于评估探针的捕获效率、均一度等性能指标。
例如,目标区域是单点,捕获的序列都是200 bp左右,远远大于目标序列,两种bed文件统计的捕获效率会有较大差异。又或者,探针设计增加补丁序列(Fix patches 和 Novel patches),单个样本中不会覆盖所有型别,两种bed文件统计的覆盖度会有较大差异。
 
6. RNA捕获和DNA捕获的探针设计方案是一样的吗?
答:艾吉泰康在DNA/RNA捕获的探针设计上是有差异的。DNA Panel按照参考基因组和目标区域进行设计,RNA Panel根据转录本进行设计。两者都会对目标序列基于多因素算法设计探针,同时RNA panel还会在每一个外显子边缘增加探针,以提高融合的检出。
 
7. TargetSeq® Panel是否可以检测CNV,需要特殊设计吗?
答:对于几十kb以上的CNV,TargetSeq® Panel可针对全基因组 / 目标区域进行 CNV 骨架设计,根据预期检测的CNV大小按照一定间隔选取高MAF的SNP位点;对于外显子水平(几百bp)的CNV,可对潜在的目标区域进行探针全覆盖等方案。针对不同的场景,艾吉泰康均可提供对应的设计方案,以提高CNV的检出。
例如,艾全外® V3 遗传版在SNP骨架设计时,首先在全基因组范围内间隔100 kb筛选出东亚人群中高MAF的SNP位点,保证全基因组大片段CNV的检出。同时,根据ClinGen筛选含重要CNV变异的基因(如DMD等),这些基因内部按照间隔10 kb筛选SNP位点,并且将外显子附近15 kb区域SNP位点的密度增加至3 kb,以实现重点区域的更高分辨率CNV检测。艾全外® V3遗传版对CNV的检测分辨率在全基因组范围内可达500 kb,加密区(超高密度SNP骨架区域)可达50 kb;但是也可以检出部分非加密区500 kb以内的CNV变异。

8. 目标区域的设计覆盖度是100%吗?
答:艾吉泰康的设计报告中会明确探针覆盖区域及探针未覆盖的目标区域(probeMissed.bed),大多数panel的设计覆盖度可以达到99%以上。探针设计过程中,会对目标序列进行热力学稳定性评估,并对热力学稳定性低的区域进行剂量补偿。但对于GC含量过高的区域,PCR扩增难度大,探针结合难度也大,最终覆盖度较差,在探针设计时会舍弃。同时对高拷贝序列或有较多的同源序列,这样的序列都会被捕获下来,影响捕获效率,也会对这些区域进行取舍。
 
9. 怎样判断TargetSeq® Panel的数据指标是否合格?
答:对于合格的样本,大多数人源DNA panel的指标可以按照Coverage rate(%)>99%、Target reads capture rate(%)>50%、T 20%X coverage rate(%)>97%进行评估,如出现异常情况,可联系艾吉泰康技术支持。动植物定制panel会因为物种、选点、品种差异较大,可根据panel测试结果辅助判断。


 

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