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MultipSeq多重扩增子定制产品

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MultipSeq多重扩增子定制产品
产品描述
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艾吉泰康MultipSeq®多重PCR扩增子测序技术是一种将多重PCR反应与二代测序相结合的靶向捕获测序技术,基于热力学稳定性算法进行全基因组水平的特异性引物设计,结合艾吉泰康完善的panel优化流程,能快速高效实现目标区域的富集和测序,完成目标区域序列的检测。

建库流程


在完成多重引物合成和制备后,艾吉泰康使用1例标准品DNA和3例测试样本gDNA(可由客户提供)进行文库构建和测序分析,以实测数据为基础,对定制试剂盒的关键指标(文库浓度,质检峰图,覆盖率和均一性等)进行优化,达到要求后进行交付。

产品特点


1. 文库构建成功率高:降低客户重构样本的风险和成本;
2. 数据产出均一性高:降低客户补测数据的风险和成本;
3. 位点覆盖率高:降低客户使用其他技术进行补点的风险和成本;
4. 数据均一性高:减少测序数据量,降低单个样本的测序费用;
5. 检出结果准确度高:降低假阳性或假阴性结果的概率。
为了达到上述高要求,艾吉泰康针对试剂盒每一项指标都会精益优化。

● 文库构建成功率高
在Panel优化阶段,研发人员以内部标准gDNA为测试样本,以不同起始量构建文库,要求40ng起始量所构文库浓度高于10ng/μl,并确保不同起始量所构文库的测序数据指标基本一致。研发人员也可以根据客户的应用需求,进行特定范围起始量的测试和评估,确保指定起始量所构文库的浓度高于10ng/μl。
客户使用上述性能的试剂盒进行大样本量文库构建时,无需对gDNA的浓度进行均一性化处理,在投入相同体积,gDNA起始量高于5ng的情况下,文库浓度均满足上机要求,最大程度保证文库构建的成功率。

● 数据产出均一性高
在Panel优化阶段,研发人员通过使用高特异性的多重引物和增强特异性扩增的试剂,确保文库质检结果中,主峰位置正确,基本没有引物二聚体小峰和大片段的非特异性杂峰。因此,定量得到的文库浓度能真实反映出目标产物的含量。在目标产物准确定量的情况下,计算出文库上机的投入量,能有效保证数据实际产生量与数据预期产出量一致,从而降低数据产出不足或过多的风险。

● 位点覆盖率高
艾吉泰康总结近500个多重panel的研发经验,发现位点未覆盖的原因分为以下4种,并总结出相应的策略进行解决,从而提高位点覆盖率。


第1种 目标位点的引物未引发扩增
分析实测数据中目标位点的测序深度可以快速判断该位点引物的扩增效率。当发现同一目标位点在多个样本中的测序深度均接近0时,表明该位点的引物扩增效果差。我们会免费设计新引物进行原有引物的替换和测试,解决位点未覆盖的问题。

 图1. 目标位点引物不工作和引物更换的示意图


第2种 扩增偏好性问题
扩增偏好性问题指同一个目标位点在不同样本中的测序深度存在差异。如下图所示,目标位点 chr19 17955043 在4号样本中的测序深度为0,在其他4个样本中的测序深度正常。引发扩增偏好性的原因很可能是引物退火结合的DNA序列存在多态性或者突变,导致引物结合效率降低,引发脱靶,最终导致目标位点的测序深度接近0。针对该问题,艾吉泰康在优化阶段,采用4个样本进行文库构建和测序,筛选出扩增偏好性的位点,免费设计引物进行更换和验证,接近扩增偏好性问题。

Chr Start End 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5
chr19 17955042 17955043 690.07 1377.26 1010.09 0 789.34

图2. 扩增偏好性和引物更换的示意图


第3种 测序质量值差引发的位点未覆盖问题

包含poly碱基序列等特殊序列结构的扩增产物在illumina平台测序时,可能会在上述区域出现测序质量很差的情况。在后续的生信分析过程中,上述区域由于测序质量值很差被过滤和截掉,导致该区域的测序深度接近0。针对该问题,艾吉泰康会免费设计特殊的引物来解决该问题,成功率为80%左右。

图3. 测序reads截短的示意图

第4种 未知原因的位点未覆盖问题

由于多重PCR反应的复杂性,某些重要位点经过反复多次优化后可能仍然无法被覆盖。在这种情况下,可以考虑将未覆盖位点的引物挑选出来,组成1个新的反应管进行扩增,然后将扩增产物与原有扩增产物进行合并,进行文库构建和测序。采用这种策略,能非常有效解决位点未覆盖的问题,但是会增加客户后续实验操作的复杂性。因此,这种方法一般只应用于必须要检出的目标位点。

图4. 难扩增位点组成T3管进行扩增


● 数据均一性高

文库数据均一性高的基础是所有扩增产物得到均衡扩增。在优化环节,艾吉泰康主要通过以下两种策略来达到均衡扩增的目标。
第1步采用均衡扩增能力强的反应体系进行第1轮多重PCR反应。如下图所示,艾吉泰康的反应体系能够对产物GC含量在20%-80%范围的目标区域实现有效扩增,最大程度上保证所有目标区域得到扩增。

图5. 1000重Panel扩增产物GC含量与测序深度的关系图

第2步根据实测数据中每个扩增产物的测序深度,使用深度学习的算法,得到每对引物的调整量,然后重新制备引物,进行文库构建和测序,分析扩增产物测序深度的变化,评估引物用量优化的效果,直到文库均一性的指标达到交付要求。

图6. 目标位点测序深度均一性优化示意图


● 检测结果准确

多重PCR靶向捕获测序技术的最终目标是实现目标区域序列碱基的准确测序,判断是否发生突变,进而给出可靠的检测结果指导下游应用。因此,检测结果的准确性至关重要。
为了评估艾吉泰康多重PCR捕获测序技术检出结果的准确性和精确性,我们使用BRCA1/2外显子捕获测序试剂盒对Horizon的标准品(货号HD795,13个已经突变位点,突变频率范围为7.5-100%)进行文库构建和测序,数据结果显示,艾吉泰康的试剂盒检出率为100%,并且每个位点检出的突变频率与理论突变频率高度一致,结果准确。此外,我们采用上述试剂盒,对不同起始量的同一样本gDNA进行文库构建和测序,结果显示不同起始量所构文库检出突变碱基的个数,类型和频率一致,并且与一代测序结果一致。

综上所述,艾吉泰康多重PCR捕获测序技术检出的突变结果准确可靠。

性能参数


引物

成对引物(15-40 nt)

目标区域大小

< 100K, 1000+ hotspots

可检测突变类型

SNP、InDel

特征

已知热点突变

实验周期

4.5 h/48 样本

适配平台

MGI, illumina

 

 

不同起始量构建文库,多重扩增子定制panel均能提供高品质的性能以及准确的测序结果

表1 10~200ng起始量所构文库的浓度和测序数据指标(BRCA1/2 外显子捕获测序Panel)

文库
编号

gDNA起始量(ng)

文库浓度(ng/μl)

原始测序数据(Mb)

比对率(%)

捕获率(%)

平均测序深度

1X 覆盖率(%)

20%平均测序深度覆盖率(%)

A01

10

5.3

19.7

99.35

81.5

682.25

100

99.82

A02

40

11.5

20.72

99.37

80.97

721.38

100

99.95

A03

100

25.8

20.61

99.42

82.37

729.26

100

99.79

A04

200

45.9

22.1

99.46

86.96

810.29

100

99.76

 

表2 唾液gDNA构建BRCA Panel检测出的突变位点信息和一代验证结果

染色体编号

突变位点

参考碱基

突变碱基

A01

A02

A03

A04

平均值 标准差  代测序验证

chr17

41223094

BRCA1

S1613G

7.5

7.6

5.4

7.6±0.9

     

chr17

41244000

BRCA1

K1183R

7.5

7.4

7.1

8.0±0.8

     

chr17

41245090

BRCA1

K820E

7.5

7.1

5

7.9±0.5

     

chr17

41234451

BRCA1

R1443STOP

32.5

32.5

23.5

35.6±2.4

     

chr17

41246245

BRCA1

D435Y

7.5

7.6

6.4

6.9±0.4

     

chr17

41244936

BRCA1

P871L

15

14.9

13.6

15.8±0.9

     

chr13

32906480

BRCA2

N289H

7.5

6.9

6.4

5.5±1.0

     

chr13

32929387

BRCA2

V2466A

100

100

100

99.5±0.1

     

chr13

32911463

BRCA2

N991D

7.5

7.4

4.7

7.2±0.3

     

chr13

32913558

BRCA2

K1691fs

32.5

32.7

28.7

32.8±0.9

     

chr13

32913836

BRCA2

N1784fs

40

39.3

33.8

40.8±0.6

     

chr13

32912750

BRCA2

D1420Y

32.5

32.7

27.9

35.1±1.8

     

chr13

32937354

BRCA2

I2675fs

10

10.4

8.6

9.9±0.7

     
                     
                     
                     

 

表3 唾液gDNA构建BRCA Panel检测出的突变位点信息和一代验证结果

染色体
编号

突变位点

参考
碱基

突变
碱基

A01

A02

A03

A04

平均值

标准差

一代测序验证结果

chr13

32906480

A

C

60.93%

56.68%

59.34%

59.72%

59.17%

1.55%

正确

chr13

32906729

A

C

25.45%

26.14%

23.47%

23.55%

24.65%

1.17%

正确

chr13

32906980

A

G

70.30%

60.77%

58.46%

65.78%

63.83%

4.58%

正确

chr13

32910721

T

C

61.59%

67.07%

63.94%

65.10%

64.43%

1.98%

正确

chr13

32911463

A

G

64.83%

64.76%

65.25%

64.17%

64.75%

0.38%

正确

chr13

32913055

A

G

100.00%

100.00%

100.00%

100.00%

100.00%

0.00%

正确

chr13

32915005

G

C

99.24%

99.19%

98.02%

99.34%

98.95%

0.54%

正确

chr13

32929387

T

C

98.84%

99.35%

98.88%

99.52%

99.15%

0.29%

正确

chr17

41223094

T

C

62.95%

65.54%

63.98%

62.13%

63.65%

1.27%

正确

chr17

41234470

A

G

33.00%

33.04%

34.69%

33.03%

33.44%

0.72%

正确

chr17

41244000

T

C

36.47%

34.37%

35.24%

34.79%

35.22%

0.79%

正确

chr17

41244435

T

C

32.22%

34.18%

41.26%

35.58%

35.81%

3.37%

正确

chr17

41244936

G

A

32.81%

36.25%

31.71%

31.56%

33.08%

1.89%

正确

chr17

41245237

A

G

33.57%

36.05%

32.65%

33.79%

34.02%

1.25%

正确

chr17

41245466

G

A

36.97%

42.45%

43.75%

32.65%

38.96%

4.44%

正确

 

 

多重扩增子定制流程


艾吉泰康开展定制产品的业务已有6年,定制流程成熟,开发经验丰富,共开发定制产品500余项,涉及遗传,肿瘤,免疫,微生物,法医,动植物育种等多个领域。客户定制产品的周期通常为25-35个工作日,开发流程如下图所示:

交付指标


(1) 1X覆盖率高于99%
(2) 20%平均测序深度高于96%

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