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影响覆盖度和均一度的因素

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1、覆盖度和均一度是什么?

  覆盖度(Coverage):表示测序数据对目标区域的覆盖情况,覆盖度越高越好。它是最重要的指标,因为如果目标区域都覆盖不到的话,也就无法检测变异。

 

  均一度(Uniformity):表示各位点的实际测序深度偏离平均深度的程度。在一次捕获实验中我们会统计各个测序深度水平的占比,均一度中最重要的指标是20% mean depth coverage,指的是达到平均测序深度的0.2倍的区域占覆盖区域的比例,该指标是行业内的共同标准。二代测序要求位点有足够高的绝对深度才可以判断检测的准确性,如果均一度好的话,不同区域的测序深度就越均匀,那么获得预期测序深度的数据量就会越小,越省钱;反之,如果均一度优化不好,会极大的加大测序费用,所以均一度也非常重要。

 

2、影响覆盖度和均一度的因素?

 

(1)样本类型和DNA质量的影响

  高通量测序的DNA样本类型来源广泛,但是不论测序样本是什么来源,最终都体现为三个指标:一是DNA的完整度,主要考虑DNA的主带是否清晰,是否有明显降解,通常FFPE样本会有明显降解,血浆cfDNA都是小片段。二是DNA的总量,我们对于建库的DNA起始投入量是有要求的,一般为200ng。血液和新鲜组织提取出的DNA量通常情况下都足够;FFPE样本因为降解程度的不同较难判断;cfDNA总量一般比较低,所以要求会适当降低。三是DNA的纯度,主要看是否有RNA、蛋白质、糖分的污染。

 

  DNA的总量不足、降解,会影响有效模板量,使有效模板量降低,即有效库容减少,FFPE和cfDNA样本通常存在总量不足、降解问题。DNA中的杂质污染,会影响样品的定量结果,使得浓度测定不准确,导致建库投入量偏低,造成有效模板量降低,即有效库容降低;杂质污染还会降低接头连接效率,使得文库转化率降低,也会导致有效库容降低。有效库容降低是影响覆盖度和均一度的重要因素。

 

  上述导致有效库容降低的原因:DNA投入量低,使得染色体拷贝份数少,建库过程中各个实验环节都会一定程度的损失小部分样品量,那么一些拷贝份数极少的区域就容易在这个过程中丢失,比如这些区域的打断片段过小,在片段筛选的时候被筛选掉了等等。那么这些丢失的区域最终就不会出现在文库中,后续测序也就测不到,无法覆盖,影响测序的覆盖度;DNA降解,也可能使得一些极短的片段在建库中丢失,无法测到;接头连接效率低,使得一些区域没有连接上接头,未转化成为最终文库,无法测到。最终检测不到,就使得目标区域的覆盖度降低。

 

  随着建库起始DNA投入量的增多,覆盖度会趋于正常。但是会有一部分区域的有效文库数量比较少,被测到的次数少,那么测序深度就会比较低,反应到数据指标上就是均一度不好。当DNA投入量再继续增加时,所有目标区域的有效文库数量都达到一定的数量,均一度也就正常了。

 

(2)PCR效率

  PCR效率可能会改变不同区域文库的比例,但是通常这部分影响不大,只有当文库发生极为显著的不均一扩增时,才会影响覆盖度和均一性。