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影响捕获效率和冗余度的九大因素

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1、捕获效率和冗余度是什么

  捕获效率(Capture Rate):表示有效数据的比例,越高越好,捕获效率越高的话,意味着达到变异检测需要的Raw Data数据量越少。需要注意的是:捕获效率和均一度这两个指标是互斥的,因为要保证目标区域上边界区的均一度,在探针设计的时候就要适当往外做延伸,这样会多测到旁边的非目标区域,会使捕获效率降低。所以,这两个指标我们在设计考虑的时候会尽可能的做到最优,但是不可能两个指标同时都达到最好。

 

  冗余度(Duplication):同一条文库通过PCR复制产生的多个相同的分子,属于无效数据。该指标主要受实验的影响。

 

2、影响捕获效率和冗余度的九大因素

 

(1)封闭试剂的影响

  杂交过程中我们会用两种封闭试剂来分别封闭Adaptor序列和人类基因组上的重复序列,因为Adaptor序列或者人类基因组上的重复序列可能会和部分目标文库的序列碱基互补结合,捕获磁珠捕获探针结合的目标区域文库的同时,这部分文库也结合在目标文库上面,后续洗脱时也洗脱不掉,从而使得这种非目标文库结合过多,导致捕获效率降低。所以不管是Adaptor序列的封闭试剂,还是人类基因组上的重复序列的封闭试剂,任意一种封闭试剂使用错误的话,都会显著降低捕获效率。

 

(2)杂交温度的影响

  杂交主要是探针和目标区域按照碱基互补配对原则结合的过程,正常的杂交温度是65℃,如果温度低于65℃,非特异性结合会增加,这种非特异性结合在后边的洗脱纯化时不会被完全洗掉,会有一部分留在了最终的捕获文库里,使得捕获效率降低。

 

(3)洗脱操作的影响

  探针杂交完成之后会进行洗脱,目的是去除非特异性文库,这一步中,含有目标区域序列的文库和探针已经结合,此时探针表面的生物素会和捕获磁珠表面的链霉亲和素结合,在洗脱时保持彼此的吸附,不会被洗脱掉。但是,不含有目标区域序列的文库因为不能和探针结合,游离于杂交体系里,洗脱时会被洗脱掉。如果洗脱不彻底,比如洗脱时振荡不充分、吹吸混匀不充分、Wash Buffer 2的洗脱温度过低、洗脱Buffer移除不干净等,都会使得最终的捕获文库里面非特异性文库残余较多,使得捕获效率降低。

 

(4)捕获磁珠的影响

  带有链霉亲和素的捕获磁珠会和探针上的生物素进行结合,在洗脱时彼此吸附,从而将目标文库捕获出来,而不含有目标区域的文库因不能和探针结合,游离在杂交体系里,被洗脱掉。如果捕获磁珠使用错误,导致非目标文库结合过多,就会降低捕获效率。

 

(5)Panel大小

  捕获效率随panel变大而升高,因为panel较小的时候,文库两边非目标区域的拉取、非特异性结合都会显著增加非目标区域数据在总数据中的占比,也使得捕获效率降低。

 

(6)PCR循环数的影响

  PCR反应只是简单的镜像复制,不能带来更多的遗传变异信息,在后续的数据分析时需要去除这种相同的分子,只留一条,所以循环数越高会导致Duplication变高,产生更多无用数据(多重PCR技术中由于其引物结合位点固定,按照Duplication的定义,扩增产物都是Duplication,所以如果去Duplication,所剩数据就会很少,所以多重PCR技术在数据分析时不去Duplication)。

 

(7)DNA起始投入量的影响

  DNA起始投入量低,FFPE样本投入量足够、但是因为样本降解以及扩增效率较低等因素,为了达到预期的文库产出,会增加PCR循环数,也会使得Duplication增高。所以,如果在合适的PCR循环数下得不到需要的DNA量,建议向前追溯原因,而不是简单的增加PCR循环。

 

(8)样本片段化

  需要保证获得适当长度的片段化的DNA,片段长度越小,导致扩增越容易,会加剧PCR 扩增的偏好性,最后引起PCR产物复杂度降低,Duplication升高。

 

(9)接头连接效率

  连接效率越高,分子多样性越高,Duplication也就越低。