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锚定多重引物设计和常规多重引物设计差异?

锚定多重引物会尽量靠近目标位点进行2条单条巢式引物设计,常规多重设计引物为上下游一对引物。
 

锚定多重扩增子技术使用的UMI接头类型?

锚定多重扩增子技术目前使用的是384种8 bp的固定UMI分子标签池。

巢式扩增的优势?

由于锚定多重使用单引物特异性延伸,相对于常规多重上下游引物扩增,特异性相对较低,而结合巢式扩增的方式,可以提高目标区域捕获的特异性。
 

锚定多重和常规多重的差异?

锚定多重扩增子技术使用单引物特异性延伸,另外一端为开放区域,接头连接时会连接上一段通用引物序列,在后续PCR过程中完成扩增。相比于常规多重扩增子,对片段化、总量较少的样本极大的提高了模板的利用率,有效的保证了低频突变的检测。
 

甲基化文库构建过程中,如果甲基化修饰的C碱基转化率较低,有哪些原因?

  1. 转化后文库被未转化文库污染。
  2. 重亚硫酸盐转化模块有效期较短,过期后严重影响试剂盒性能。重亚硫酸盐容易发生氧化,结晶析出,导致重亚硫酸盐溶液浓度降低,影响转化效率。
  3. DNA样本投入量过高。
     

甲基化捕获方法中,先捕获后转化和先转化后捕获最大的区别是什么?

PCR扩增会改变甲基化状态,所以PCR扩增在转化后进行。

● 建库:

Pre-BS:先接头连接后BS转化;如:甲基化双链建库,对于原始DNA分子进行接头连接后,进行BS转化,BS转化会对DNA造成损伤产生断裂,单双链DNA混合,对于断裂的或者单链DNA分子无法进行接头连接,所需的样本起始量较高。

Post-BS:先转化后接头连接;如:甲基化单链建库,对于原始DNA分子进行BS转化,对单链DNA分子进行接头连接,这样BS转化后断裂DNA分子和单链DNA分子可以进行文库构建,降低了样本的起始量。

● 捕获:

Pre-BS:先捕获后转化,首先对DNA分子进行建库,再进行杂交捕获,由于PCR扩增会改变甲基化状态,进行的是PCR-free建库和捕获,需要的原始DNA分子很多,要达到μg级别。

Post-BS:先转化后捕获,在建库流程中进行转化,再进行PCR扩增,这样捕获之前进行PCR扩增,降低了建库的投入量,通常需要几到几百ng。

甲基化Panel设计原理?

对于甲基化Panel的设计,艾吉泰康采用正负链双态设计原理:

正负链设计:双链DNA的正负链发生甲基化情况并不一样,艾吉泰康对于这种情况,对正负链分别设计探针,能提高甲基化的检出率。

双态设计:当一段DNA中含有多个胞嘧啶(C),并且相连时,艾吉泰康对所有相连的胞嘧啶(C)都发生甲基化和相连的胞嘧啶(C)都不发生甲基化两种状态进行探针设计。

对于甲基化大Panel,可以做定制吗?

我们可以提供甲基化的半定制,即可以在甲基化大Panel的基础上增加其他区域的探针或者加密某些区域的探针;我们也提供甲基化全定制,可以根据老师的需求进行探针设计。

甲基化双链建库的接头和普通杂交捕获文库的接头是否一致?

甲基化双链建库的Adapter和普通杂交捕获文库的Adapter序列是一致的,但是甲基化双链建库的Adapter的C碱基是甲基化C碱基,需要分别订购。

甲基化大Panel目标区域多大?推荐的测序深度?数据量是多少?

CGI panel的目标区域大约21.2 Mb,测序深度、数据量和样本类型、样本质量及建库投入量有关,例如:质检合格的gDNA样本,按照常规投入量200 ng进行建库,去重后测序深度为100X时,需要10 Gb左右数据量。

艾吉泰康甲基化建库试剂盒构建甲基化文库的DNA投入量为多少?

IGT™ Methyl Fast Library Prep Kit v2.0试剂盒,DNA投入量推荐为20 ng-200 ng。

IGT™ ssDNA Library Prep Kit v2.0试剂盒,DNA投入量可低至1 ng。

存在多种单倍型的位点,后续数据分析时是否需要考虑各种单倍型?参考基因组如何选择?

如果没有单倍型分型需求,建议直接去掉补丁序列,仅使用24条染色体的参考基因组的信息进行分析;如果有单倍型分型需求,由于单倍型分型难度较大,在区域选择和引物设计时,均需要进行专门的沟通。

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