常见问题分类
锚定多重引物设计和常规多重引物设计差异？
锚定多重引物会尽量靠近目标位点进行2条单条巢式引物设计，常规多重设计引物为上下游一对引物。
锚定多重扩增子技术使用的UMI接头类型？
锚定多重扩增子技术目前使用的是384种8 bp的固定UMI分子标签池。
巢式扩增的优势？
由于锚定多重使用单引物特异性延伸，相对于常规多重上下游引物扩增，特异性相对较低，而结合巢式扩增的方式，可以提高目标区域捕获的特异性。
锚定多重和常规多重的差异？
锚定多重扩增子技术使用单引物特异性延伸，另外一端为开放区域，接头连接时会连接上一段通用引物序列，在后续PCR过程中完成扩增。相比于常规多重扩增子，对片段化、总量较少的样本极大的提高了模板的利用率，有效的保证了低频突变的检测。
甲基化文库构建过程中，如果甲基化修饰的C碱基转化率较低，有哪些原因？
- 转化后文库被未转化文库污染。
- 重亚硫酸盐转化模块有效期较短，过期后严重影响试剂盒性能。重亚硫酸盐容易发生氧化，结晶析出，导致重亚硫酸盐溶液浓度降低，影响转化效率。
- DNA样本投入量过高。
甲基化捕获方法中，先捕获后转化和先转化后捕获最大的区别是什么？
PCR扩增会改变甲基化状态，所以PCR扩增在转化后进行。
● 建库：
Pre-BS：先接头连接后BS转化；如：甲基化双链建库，对于原始DNA分子进行接头连接后，进行BS转化，BS转化会对DNA造成损伤产生断裂，单双链DNA混合，对于断裂的或者单链DNA分子无法进行接头连接，所需的样本起始量较高。
Post-BS：先转化后接头连接；如：甲基化单链建库，对于原始DNA分子进行BS转化，对单链DNA分子进行接头连接，这样BS转化后断裂DNA分子和单链DNA分子可以进行文库构建，降低了样本的起始量。
● 捕获：
Pre-BS：先捕获后转化，首先对DNA分子进行建库，再进行杂交捕获，由于PCR扩增会改变甲基化状态，进行的是PCR-free建库和捕获，需要的原始DNA分子很多，要达到μg级别。
Post-BS：先转化后捕获，在建库流程中进行转化，再进行PCR扩增，这样捕获之前进行PCR扩增，降低了建库的投入量，通常需要几到几百ng。
甲基化Panel设计原理？
对于甲基化Panel的设计，艾吉泰康采用正负链双态设计原理：
正负链设计：双链DNA的正负链发生甲基化情况并不一样，艾吉泰康对于这种情况，对正负链分别设计探针，能提高甲基化的检出率。
双态设计：当一段DNA中含有多个胞嘧啶（C），并且相连时，艾吉泰康对所有相连的胞嘧啶（C）都发生甲基化和相连的胞嘧啶（C）都不发生甲基化两种状态进行探针设计。
对于甲基化大Panel，可以做定制吗？
我们可以提供甲基化的半定制，即可以在甲基化大Panel的基础上增加其他区域的探针或者加密某些区域的探针；我们也提供甲基化全定制，可以根据老师的需求进行探针设计。
甲基化双链建库的接头和普通杂交捕获文库的接头是否一致？
甲基化双链建库的Adapter和普通杂交捕获文库的Adapter序列是一致的，但是甲基化双链建库的Adapter的C碱基是甲基化C碱基，需要分别订购。
甲基化大Panel目标区域多大？推荐的测序深度？数据量是多少？
CGI panel的目标区域大约21.2 Mb，测序深度、数据量和样本类型、样本质量及建库投入量有关，例如：质检合格的gDNA样本，按照常规投入量200 ng进行建库，去重后测序深度为100X时，需要10 Gb左右数据量。
艾吉泰康甲基化建库试剂盒构建甲基化文库的DNA投入量为多少？
IGT™ Methyl Fast Library Prep Kit v2.0试剂盒，DNA投入量推荐为20 ng-200 ng。
IGT™ ssDNA Library Prep Kit v2.0试剂盒，DNA投入量可低至1 ng。
存在多种单倍型的位点，后续数据分析时是否需要考虑各种单倍型？参考基因组如何选择？
如果没有单倍型分型需求，建议直接去掉补丁序列，仅使用24条染色体的参考基因组的信息进行分析；如果有单倍型分型需求，由于单倍型分型难度较大，在区域选择和引物设计时，均需要进行专门的沟通。
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